PRÁCTICA: BILIRRUBINA DIRECTA Y TOTAL SEGÚN EL MÉTODO DE JENDRASSIK-GROFBY (23/01/18)

BILIRRUBINA DIRECTA

- INTRODUCCIÓN

La bilirrubina se origina por degradación del grupo hemo de la hemoglobina, que a su vez aparece en el plasma como consecuencia de la destrucción de los glóbulos rojos en el sistema retículo endotelial. La hemoglobina, una vez liberada en el interior del eritrocito, se combina con las haptoglobinas, proteínas plasmáticas específicas para su transporte. En una primera etapa y tras su liberación de la haptoglobina, se forma, por acción de una oxigenasa, un grupo formilo, con lo que se rompe el anillo tetrapirrólico del hem, formándose el compuesto denominado biliverdina, que en una etapa posterior y por acción de una reductasa se transforma en bilirrubina.

- FUNDAMENTO DEL MÉTODO

La bilirrubina en presencia de ácido sulfanílico diazotado forma, en un medio alcalino, un azo-compuesto de color rojo, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de bilirrubina total presente en la muestra.

- UTILIDAD CLÍNICA

La bilirrubina, compuesto de degradación de la hemoglobina, es captada por el hígado para su conjugación y excreción en la bilis. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias. La eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido es una patología provocada por incompatibilidad maternofetal en la que se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina sérica con el consecuente riesgo de difusión del pigmento al sistema nervioso central, por lo que la determinación de la bilirrubina en estos niños recién nacidos resulta sumamente importante. 

- REACTIVOS

REACTIVO 1 Bilirrubina directa	Ácido sulfanílico                          30 mmol/L Ácido clorhídrico                         150 mmol/L
REACTIVO 2	Nitrito de sodio                            29 mmol/L

- MATERIAL

• Tubos de ensayo
• Micropipetas
• Puntas de pipeta
• Cubetas para el espectrofotómetro

- MUESTRA

Suero libre de hemólisis

- APARATAJE

Espectrofotómetro

- PROCEDIMIENTO

1. Preparamos el blanco y la muestra añadiendo 1.500 microlitro de R1 en dos tubos de ensayo.

A continuación, añadimos 100 microlitros de suero para el blanco, y otros 100 microlitros de suero en la muestra, y por último, añadimos 50 microlitros de R2 a la muestra 

NOTA: En está práctica no se maneja patrón.

2. Lo mezclamos bien y esperamos 5 minutos a temperatura ambiente

3. Leemos la absorbancia en el espectrofotómetro:

- Introducimos en una cubeta agua destilada para ajustar a 0 (blanco)

- Medimos el blanco directo

- Medimos la muestra

- RESULTADOS

• Absorbancia del blanco = 0
• Absorbancia del blanco directo = 0,047 A
• Absorbancia de la muestra = 0,118 A

 

- CÁLCULOS

(Absorbancia Muestra - Absorbancia  Blanco Directo) x 22 = 1,562 mg/dl bilirrubina directa

                                                      BILIRRUBINA TOTAL

- FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Casi todas las técnicas de cuantificación de la bilirrubina se basan en la reacción de Malloy-Evelyn, que valora colorimétricamente por la formación de azobilirrubina, de color rojo cereza, cuando a la bilirrubina se la hace reaccionar en determinadas condiciones con el ácido sulfanílico diazotado.

La bilirrubina conjugada, muy polar, reacciona en medio acuoso con el reactivo de diazotación, por lo que se le llamó directa, pues al poner en contacto el suero y el reactivo aparecía directamente el color. Sin embargo, la bilirrubina libre, poco polar, no da directamente la reacción y es preciso añadir un tercer reactivo -que inicialmente fue el metanol- para que se produzca la reacción de diazotación con la consiguiente aparición del color, por este motivo se llamó bilirrubina indirecta.

- SIGNIFICADO CLÍNICO

Desde un punto de vista analítico y clínico, interesa conocer los niveles de bilirrubina total y diferenciar cuantitativamente la "bilirrubina libre" o prehepática que aumenta principalmente en procesos de tipo hemolítico, de la "bilirrubina conjugada" o hepática que está incrementada en la disfunción hepática y más concretamente en fallos de los mecanismos de su eliminación, a través del sistema biliar, cuyo primer paso es pasar del hepatocitos a los canalículos biliares.

- REACTIVOS

REACTIVO 1 Bilirrubina total	Ácido sulfanílico               30 mol/L Ácido clorhídrico              50 mmol/L Dimetilsulfóxido                7 mol/L
REACTIVO 2	Nitrito de sodio                29 mmol/L

- MATERIAL

• Tubos de ensayo
• Micropipetas
• Puntas de pipeta
• Cubetas para el espectrofotómetro

- MUESTRA

Suero libre de hemólisis

- APARATAJE

Espectrofotómetro

- PROCEDIMIENTO

1. Preparamos el blanco total  y la muestra

	BLANCO TOTAL	TOTAL
R1 Bilirrubina total R2 Nitrito sódico Muestra	1,5 ml -            100 microlitros	1,5 ml 50 microlitros 100 microlitros

2. Mezclamos y esperamos 5 minutos a temperatura ambiente.

3. Leemos la absorbancia en el espectrofotómetro:

- Introducimos en una cubeta agua destilada para ajustar a 0 (blanco)

- Medimos el blanco total

- Medimos la muestra

- RESULTADOS

• Absorbancia del blanco = 0
• Absorbancia del blanco total = 0,025 A
• Absorbancia de la muestra = 0,125 A

- CÁLCULOS

(Absorbancia Muestra Total - Absorbancia  Blanco Total) x 22 = 2,2 mg/dl bilirrubina total

- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Valores normales bilirrubina total:

Adultos Neonatos: Niños 1 semana Niños 1 mes

Hasta 1 mg/dl Hasta 5 mg/dl Hasta 12 mg/dl Hasta 1,5 mg/dl