PRÁCTICA: INMUNODOTTING PARA HEPATITIS AUTOINMUNES (14/12/17)

INMUNODOTTING PARA HEPATITIS AUTOINMUNES

- UTILIDAD CLÍNICA

Alphadia Liver Profile Dot es un kit de inmunodoting destinado a la detección en suero humano de auto-Ac tipo IgG/IgM antimitocondriales dirigidos contra los siguientes Ag: M2/PDC nativo (subunidades E1, E2 y E3 del complejo Piruvato Deshidrogenasa) y M2 recombinante (mezcla de las subunidades E2 del complejo Oxoglutarato Deshidrogenasa, de la cadena ramificada del complejo Deshidrogenasa Ácida y del complejo Piruvato Deshidrogenasa).

- PRINCIPIO DE LA PRUEBA

La prueba se basa en el principio del Enzimoinmunoanálisis. Cada tira del test está compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico; en dicha membrana se han dispensado directamente los distintos Ag anteriormente mencionados. Durante el desarrollo de la prueba, las tiras se incuban con suero diluido de los pacientes. Si dichos sueros contienen los auto-Ac buscados, se unirán específicamente al correspondiente Ag de los fijados en la membrana. Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se han unido sus Ag para, posteriormente, añadir un conjugado de origen caprino marcado con ALP; dicho conjugado va dirigido contra la Ig G humana. El conjugado se une a los complejos Ag-Ac. Después de realizar un segundo lavado con el fin de eliminar el exceso de conjugado, se añade el sustrato que, por acción de la enzima ALP, desarrollará una coloración púrpura en el lugar correspondiente de la membrana. Dicha coloración tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.

- MATERIAL

• Bandeja de incubación
• Pipetas automáticas con sus respectivas puntas
• Pipetas Pasteur
• Tiras dot

- REACTIVOS

1.- Para ser diluido:

• Tampón de lavado concentrado 10x (1x40 mL): Tapón incoloro

2.-  Listo para usar:

• Tampón de dilución (1x40 mL): Tapón amarillo.
• Conjugado (1x40 mL): Tapón rojo.
• Sustrato (1x40 mL): Bote marrón. Éste, reacciona con la enzima produciendo un cambio de color.

- PROCEDIMIENTO

1. Ralizamos la dilución del tampón de lavado concentrado 10x preparando 50 mL al 1/10. 
Para ello, introducimos en una probeta 5 ml de tampón y 45 mL de agua destilada.

2. Colocamos una tira por paciente en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules mirando hacia arriba.

3. Añadimos 2 ml de tampón de lavado en cada canal usado e incubamos durante 10 minutos en agitación. Si se ha realizado una correcta incubación, los puntos azules de la tira desaparecerán por completo.

4. Eliminar el líquido de los canales mediante succión con una pipeta Pasteur. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

5. Añadir 1,5 ml de tampón de dilución en cada uno de los canales utilizados.

6. Añadimos 10 microlitros de muestra del paciente por canal e incubamos durante 30 minutos en agitación. Se debe evitar tocar la membrana con las puntas de las pipetas. La muestra se debe dispensar sobre la parte superior de la tira (zona de la etiqueta de plástico).

7. Eliminamos el líquido de los canales mediante succión con una pipeta Pasteur. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

8. Lavamos 3 veces cada canal utilizado (durante 3 minutos cada vez) con 1,5 ml de tampón de lavado y agitamos. Después de cada lavado eliminamos el liquido de los canales mediante succión con una pipeta Pasteur.

9. Añadimos 1,5 mL de conjugado por canal utilizado e incubamos 30 minutos en agitación.

10. Eliminamos el líquido de los canales.

11. Lavamos tres veces cada canal utilizado con 1,5 ml de tampón de lavado, y agitamos. Después de cada lavado, eliminamos el líquido de los canales.

12. Añadimos 1,5 ml de sustrato por canal utilizado e incubamos 10 minutos en agitación.

13. Eliminamos el líquido de los canales.

14. Lavamos una vez más (durante 3 minutos) con 1,5 ml de tampón de lavado para detener la reacción.

15. Extraemos las tiras de los canales y las dejamos secar en papel absorbente.

- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

1. Despegamos la cubierta del adhesivo en la parte posterior de cada tira y colocamos dichas tiras con los puntos boca arriba junto a la hoja de interpretación proporcionada en el kit. Este indicará las posiciones respectivas de los diferentes controles y antígenos en la membrana.

2. El punto superior (control positivo) debe aparecer coloreado en todos los pacientes. Sólo un punto de control de reacción claramente positiva asegura que los resultados son válidos, que la prueba se desarrolló correctamente y/o los reactivos no se han degradado.

3. En condiciones óptimas, y si la muestra está libre de sustancias que interfieran, el control negativo (el punto inferior) será incoloro. La aparición de color en el punto de control negativo indica la existencia de uniones inespecíficas debidas a sustancias con capacidad de interferir y que están presentes en la muestra.

4. Comparamos el punto correspondiente a cada antígeno específico con el punto de control negativo.

* Resultado positivo: Una muestra es positiva para un anticuerpo específico si la intensidad de color del punto correspondiente a su Ag es mayor que la intensidad de color del control negativo.

* Resultado negativo: Una muestra es negativa para un anticuerpo específico si la intensidad de color del punto correspondiente a su Ag es menor o igual que la intensidad de color del control negativo.

En nuestro caso, el resultado es negativo ya que además del punto superior, no ha sido coloreado ningún otro punto.