PRÁCTICA: INMUNODIFUSIÓN RADIAL (28/11/17)


INMUNODIFUSIÓN RADIAL DE MANCINI


- FUNDAMENTO


Es una técnica que nos permite la identificación y cuantificación de un antígeno concreto (una proteína, por ejemplo). En esta técnica, el antígeno se aplica en unos pocillos realizados en un gel de agarosa que contiene una concentración conocida de anticuerpo (antisuero) específico.
En cada pocillo, el antígeno aplicado difunde a través del gel de forma concéntrica hasta alcanzar una zona de equivalencia con el anticuerpo, dando lugar a inmunocomplejos que forman un anillo de precipitado (un círculo) alrededor del pocillo. El diámetro de cada anillo es proporcional a la concentración del antígeno.

- OBJETIVO

 Comprobar la existencia de albúmina en una muestra de suero y determinar su concentración, en caso de que exista.

- APARATAJE


  • Baño termostático
  • Microondas


- MUESTRA

Muestra de suero con concentración de IgG


- MATERIAL Y REACTIVOS

  • Placas de Petri de 55 mm de diámetro.
  • Pipetas automáticas con sus correspondientes puntas.
  • Tubos eppendorf con capacidad para 1 ml.
  • Patrones de Ig G (0’05, 0’1, 0’2y 0’4 mg/ml)
  • Anticuerpo anti-Ig G Bovina
  • Agua destilada
  • Agarosa
  • Tampón de inmunodifusión radial
  • Cámara húmeda

 


- PROCEDIMIENTO


1. Preparación de los patrones: Debemos descongelar los patrones de IgG y el anticuerpo anti-IgG que vienen con el kit.

2. Preparación de las placas de agarosa: 

- En un matraz Erlenmeyer, añadimos 1,5 gramos de agarosa y 100 ml de tampón de inmunodifusión.


 


- Calentamos la disolución de agarosa en el microondas hasta su completa transparentación
- Dejamos enfriar hasta 45ºC 
- Una vez, que la disolución ha alcanzado dicha temperatura, dispensamos unos 8-9 ml por placa de Ac ant-Ig G Bovina (la placa debe estar situada sobre una superficie horizontal hasta su solidificación, y se debe procurar no hacer burbujas durante la dispensación).


                                                                  

- Cuando la placa esté completamente sóida, realizaremos cinco pocillos formando un cuadrado y un pocillo central (utilizamos una pipeta Pasteur cerrada).




3. Prepación de 3 láminas de papel de filtro, con la forma de la placa de Petri

4. Dispensación de muestra: En el pocillo central, añadimos 10 microlitros de suero sanguíneo de concentración 1/100




5. Dispensación de patrones: Poner 10 microlitros de los patrones en los pocillos del cuadrado (un patrón en cada pocillo, manteniendo el ordena de mayor a menor concentración)
  • POCILLO 1: 0.05 mg/ml
  • POCILLO 2: 0.1 mg/ml
  • POCILLO 3: 0.4 mg/ml
  • POCILLO 4: 0.4 mg/ml.


6. Difusión de Ag y Ac: Colocar la placa con los patrones y muestra en una cámara húmeda durante 24 horas y observar los resultados (la cámara húmeda se realiza con papel de filtro y agua destilada)





7. Lectura y cuantificación: Medimos el diámetro de los anillos de precipitación y realizamos una curva de calibración enfrentando el cuadrado de los diámetros de los patrones con su concentración. Tras medir el diámetro de la muestra, calculamos su concentración por interpolación con ayuda de la curva de calibración.




- RESULTADOS








Concentración de la muestra: 0,037 mg/ml



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